bio4emmanuel: abril 2010

OBSERVACION DE LA MITOSIS EN CÉLULAS MERISTEMÁTICAS
DE RAÍZ DE CEBOLLA (Allium cepa)http://www.amemi.org/Docs/simposia_biologia/carteles/36_OBSERVACION_DE_LA_MITOSIS_EN_C%C3%89LULAS_MERISTEM%C3%81TICAS.pdf
CON EL MICROSCOPIO DE FUERZA ATÓMICA
Cruz-Gómez, Sarai de Jesúsa,*; Segura-Valdez, María de Lourdesb,*;
Jiménez-García, Luis Felipec,*.
*Laboratorio de Nanobiología Celular, Departamento de Biología Celular, Facultad de Ciencias, UNAM. Circuito
Bibliografía
[1] Alberts, B. et al. Molecular Biology of The Cell, 4ª ed.Garland Sciences. Nueva York. (2002).
[2] López-Sáez, J.F., et al. Duration of the cell division cycle and its dependence on temperatura. Z. Zellforsh. 75
(1966) 591-600.
[3] Lamond, A.I. & Earnshaw, W.C. Structure and function in the nucleus. Science 280 (1998) 547-553.
[4] Jiménez-García, L.F., Segura-Valdez, M.L., Visualizing Nuclear Structure in situ by Atomic Force Microscopy.
En: Braga, P.C. y Ricci, D. Eds. Atomic Force Microscopy: Methods and Applications. Methods in Molecular
Biology 242 (2004)191-199. Humana Press. New Jersey, USA.
[5] Jímenez-García L.F., et al.1998, Biología celular de Lacandonia schismatica. Análisis por Microscopía
Electrónica y de Fuerza Atómica, Bol. Soc. Bot., México 62: 5-14.
[6] Binnig G., Quate C.F., Gerber C., Atomic Force Microscope, Physical Review Letters 56 (1986) 930-933
Exterior, Ciudad Universitaria, Coyoacán 04510, México D.F., México.
a Tesista, Licenciatura en Biología, b Doctora, Profesor de Asignatura Ordinario B, Profesor Ordinario de Carrera
Titular A T.C., c Doctor, Profesor de Asignatura Ordinario B, Profesor Ordinario de Carrera Titular C T.C.,
Teléfono: (55) 5622-5396 sarichuy@yahoo.com.mx
Introducción
Para la comprensión del sustrato celular de la herencia, es preciso analizar los mecanismos reguladores de eventos
bioquímicos secuenciales y continuos en la célula [1]. De igual forma para conocer lo que sucede en la célula durante
la mitosis es preciso delimitar la trayectoria de los eventos que se llevan a cabo dentro de ella.
Este trabajo comprende una visión diferente a las anteriores de un proceso fundamental sucedido en todos los
organismos eucariontes para generar nuevas células y nuevos organismos; el de la mitosis [2]. Aunque el proceso de
división celular ha sido caracterizado desde hace muchos años atrás en diversos tipos celulares, con diferentes
técnicas y con diferentes instrumentos; en los resultados de este trabajo se muestran imágenes obtenidas in situ [3-5]
con el Microscopio de Fuerza Atómica de células de raíz de cebolla en división celular.
En la elaboración de este trabajo principalmente se usó el Microscopio de Fuerza Atómica [6], un instrumento que en
las ciencias biológicas tiene tan sólo algunos años en haberse empezado a usar, su mecanismo permite obtener
imágenes reales y en tercera dimensión de la muestra en estudio además de ofrecer una resolución mayor al
Microscopio Electrónico de Transmisión [7]. En el AFM una aguja “barre” el relieve de la muestra y por medio de
un programa de cómputo lo transforma en una observación que puede ser interpretada como una imagen en tercera
dimensión. La muestra referida es un corte muy delgado (0.2 μm) de la punta de una raíz de cebolla que fue
procesada con la técnica convencional de microscopía electrónica [8].
Objetivo
Observar y reconocer estructuras celulares correspondientes a las etapas de la mitosis en células meristemáticas de la
raíz de cebolla (Allium cepa) con el microscopio de fuerza atómica.
Analizar si el microscopio de fuerza atómica permite resolver estructuras celulares involucradas en la expresión
fenotípica de la división celular.
Metodología
Se utilizaron meristemos de raíces de cebolla obtenidos a partir de crecimiento de cebollas en agua, durante 3 a 4
días, a temperatura ambiente [9]. Las muestras se procesaron de acuerdo con técnicas estándar para microscopía
electrónica, se tomaron los meristemos de la raíz de cebolla y se fijaron con glutaraldehído al 6% en amortiguador
PBS a pH 7.2 durante 16 horas. Las muestras después se lavaron con PBS y se postfijaron con tetraóxido de osmio al
1% durante varias horas. Posteriormente se enjuagaron y se deshidrataron en una serie de etanol a concentraciones
graduales, finalizando con óxido de propileno. La preinclusión se llevó a cabo con una mezcla de óxido de propileno
y resina epóxica, en proporción 1:1 durante 16 horas. Finalmente las muestras se incluyeron en resina epóxica
durante 16 horas a 60oC. Se obtuvieron cortes semifinos de unos 200 nm de espesor, con una cuchilla de vidrio y
utilizando un ultramicrotomo marca Leica, modelo Ultracut. Los cortes se montaron al calor sobre portaobjetos de
vidrio y se tiñeron con azul de toluidina. Otros cortes se montaron sobre portaobjetos y no fueron teñidos.
Los cortes semifinos teñidos o sin teñir se observaron con un microscopio de fuerza atómica modelo BioScope
(Digital Instruments, Santa Barbara CA, USA) operando en modo de contacto y zapping con un controlador
Nanoscope IIIa. El microscopio trabaja sobre un microscopio invertido Diaphot 200 (Nikon). Se utilizó un scanner
de 100 μm y puntas de nitruro de silicio de 20-50 nm de radio de curvatura (modelo NP). Se utilizaron velocidades
de barrido de entre 1.969 a 1.285 Hz, una fuerza de 10 nN y una ganancia de 0.5 unidades arbitrarias [10].
PBS a pH 7.2 durante 16 horas. Las muestras después se lavaron con PBS y se postfijaron con tetraóxido de osmio al
1% durante varias horas. Posteriormente se enjuagaron y se deshidrataron en una serie de etanol a concentraciones
graduales, finalizando con óxido de propileno. La preinclusión se llevó a cabo con una mezcla de óxido de propileno
y resina epóxica, en proporción 1:1 durante 16 horas. Finalmente las muestras se incluyeron en resina epóxica
durante 16 horas a 60oC. Se obtuvieron cortes semifinos de unos 200 nm de espesor, con una cuchilla de vidrio y
utilizando un ultramicrotomo marca Leica, modelo Ultracut. Los cortes se montaron al calor sobre portaobjetos de
vidrio y se tiñeron con azul de toluidina. Otros cortes se montaron sobre portaobjetos y no fueron teñidos.
Los cortes semifinos teñidos o sin teñir se observaron con un microscopio de fuerza atómica modelo BioScope
(Digital Instruments, Santa Barbara CA, USA) operando en modo de contacto y zapping con un controlador
Nanoscope IIIa. El microscopio trabaja sobre un microscopio invertido Diaphot 200 (Nikon). Se utilizó un scanner
de 100 μm y puntas de nitruro de silicio de 20-50 nm de radio de curvatura (modelo NP). Se utilizaron velocidades
de barrido de entre 1.969 a 1.285 Hz, una fuerza de 10 nN y una ganancia de 0.5 unidades arbitrarias [10].
PBS a pH 7.2 durante 16 horas. Las muestras después se lavaron con PBS y se postfijaron con tetraóxido de osmio al
1% durante varias horas. Posteriormente se enjuagaron y se deshidrataron en una serie de etanol a concentraciones
graduales, finalizando con óxido de propileno. La preinclusión se llevó a cabo con una mezcla de óxido de propileno
y resina epóxica, en proporción 1:1 durante 16 horas. Finalmente las muestras se incluyeron en resina epóxica
durante 16 horas a 60oC. Se obtuvieron cortes semifinos de unos 200 nm de espesor, con una cuchilla de vidrio y
utilizando un ultramicrotomo marca Leica, modelo Ultracut. Los cortes se montaron al calor sobre portaobjetos de
vidrio y se tiñeron con azul de toluidina. Otros cortes se montaron sobre portaobjetos y no fueron teñidos.
Los cortes semifinos teñidos o sin teñir se observaron con un microscopio de fuerza atómica modelo BioScope
(Digital Instruments, Santa Barbara CA, USA) operando en modo de contacto y zapping con un controlador
Nanoscope IIIa. El microscopio trabaja sobre un microscopio invertido Diaphot 200 (Nikon). Se utilizó un scanner
de 100 μm y puntas de nitruro de silicio de 20-50 nm de radio de curvatura (modelo NP). Se utilizaron velocidades
de barrido de entre 1.969 a 1.285 Hz, una fuerza de 10 nN y una ganancia de 0.5 unidades arbitrarias [10].